基于母亲血浆单体型方法的甲型血友病无创产前基因检测分析
选自：中华妇产科杂志2019 年4月第54卷第4期
作者：何志晖1 陈超2 林晓莹3 蒋璐2 安晓英2 柳晓瑜2 蒋玮莹3 孙隽2
1 广州医科大学附属第一医院妇产科510120；2 滨海华大基因产业研究院，天津300308；3中山大学中山医学院医学遗传学教研室，广州510080
通信作者：何志晖，Email：zhhe@hotmail.com
目的
探讨应用基于母亲血浆单体型方法进行甲型血友病无创产前基因检测（NIPT）的可行性。
方法
招募1个甲型血友病高风险家系，孕妇及先证者（孕妇弟弟）经长距离PCR技术检出凝血因子Ⅷ基因内含子22倒位。首先对孕妇、其配偶及先证者的外周血DNA进行目标区域捕获测序，获得与致病位点连锁的单体型信息；再构建隐Mmarkov模型，使用Viterbi算法推断在凝血因子Ⅷ基因区域，胎儿从父母获得的单体型是否与先证者一致。并取胎儿脐静脉血行长距离PCR验证NIPT的准确性。
结果
本例胎儿基于母亲血浆单体型方法进行甲型血友病NIPT的结果为正常男性，且与胎儿脐静脉血的长距离PCR技术验证的结果一致。
结论
基于母亲血浆单体型方法可对甲型血友病进行NIPT，可在临床推广应用。
1. 使用NIPT分析HA的意义：
HA是X连锁隐性遗传性凝血功能障碍性疾病，其临床表现为反复自发性或轻微损伤后出血不止，出血可发生在任何部位，但以关节出血最为常见，反复多次关节出血可使患者致残，出血严重者甚至可导致颅内出血而危及生命。对HA尚无有效的根治性措施，只能用FⅧ制品或新鲜血浆替代治疗。开展HA携带者检测及产前诊断是有效控制致病基因传递，降低发病率的主要措施。本课题组的前期研究已建立了中国人群甲型血友病的分子诊断方法［6］。获得HA先证者和携带者孕妇的基因型后，可进行侵入性产前诊断；但绒毛穿刺取样术、羊膜腔穿刺术和脐静脉穿刺术等传统的侵入性产前诊断方法，可能会对胎儿和孕妇造成危害。因此，探求HA的NIPT分析方法具有重要的临床意义。
母亲血浆中胎儿DNA的发现为NIPT提供了可能。已有研究报道，NIPT 对染色体非整倍体诊断的准确率非常高［7⁃8］。通过对母亲血浆中游离胎儿DNA的全基因组测序，获得胎儿特异性等位基因的准确率超过95%，使单基因病的NIPT成为可能［9⁃10］。但因全基因组测序费用高，限制了其在临床上的应用。Lam等［11］报道，使用目标区域捕获测序进行了β⁃地中海贫血的NIPT，为单基因病的NIPT提供了新的选择。
NIPT可通过母亲外周血实施，获取标本的方法比侵入性产前诊断更方便，并可在妊娠12周进行。得到结果后，可让孕妇及家属及时作出是否放弃患儿的决定，越早终止妊娠对母亲的伤害越小。此外，NIPT为有侵入性产前诊断禁忌证或担心侵入性产前诊断的并发症而拒绝手术的孕妇提供了新的选择。
2. 基于母亲血浆的单体型方法进行NIPT的可行性：
通过孕妇血浆中游离胎儿DNA判断胎儿性别可帮助进行HA的产前诊断，女性胎儿最严重的情况是携带者，但不能判断男性胎儿是否为患儿。Tsui等［12］采用微滴化数字PCR技术进行HA的NIPT，其缺点是仅能对FⅧ基因的点突变进行检测，对高发的FⅧ基因的内含子倒位突变无法检测，这是微滴化数字PCR技术的局限性；且单例样本的检测费用相对昂贵，1张微滴化数字PCR芯片需几千美元。
本课题组研发出基于母亲血浆的单体型方法进行NIPT的方法。采用这种方法，已成功进行了很多常染色体隐性遗传性单基因病的NIPT，包括苯丙酮尿症、先天性肾上腺皮质增生症、枫糖尿症、先天性耳聋、脊髓性肌萎缩症和肌营养不良症［13⁃17］。
本研究首次采用基于母亲血浆单体型方法进行HA的NIPT。性别判断对X连锁隐性遗传病的诊断非常重要，采用Y染色体探针进行性别判断简单、准确。采用母亲血浆中的游离胎儿DNA，捕获Y染色体的范围和深度，在男性胎儿和女性胎儿中明显不同，女性胎儿几乎为0，因此NIPT判断胎儿的性别非常准确。本研究结果显示，使用母亲外周血游离胎儿DNA进行NIPT的结果与脐静脉穿刺术行侵入性产前诊断的结果吻合，两种方法的结果均判断本例胎儿为正常胎儿。
虽然NIPT比侵入性产前诊断有更多优势，但NIPT对HA产前诊断的准确性有待进一步提高。随着准确性的提高和费用的降低，NIPT将为HA及其他X连锁遗传性疾病的产前诊断提供快速、简易的新选择
参考文献：略
本文编辑：江琪琪
