肝素结合表皮生长因子调控核因子κB诱导卵巢上皮性癌紫杉醇耐药的作用及机制
选自：中华妇产科杂志2019 年4月第54 卷第4期
作者：汤小晗卢美松邓锁李萌
哈尔滨医科大学附属第一医院妇产科150001
通信作者：卢美松，Email：lumeisong0417@163.com
探讨肝素结合表皮生长因子（HB-EGF）通过上调核因子κB（NF-κB）的表达从而诱导卵巢上皮性癌（卵巢癌）对紫杉醇耐药的作用及可能的机制。
（1）NF-κB表达的检测：将卵巢癌亲本细胞系A2780细胞和紫杉醇耐药细胞系A2780/Taxol细胞及其对应的裸鼠分成4组，即A2780组、A2780+交叉反应物质197（CRM197，为HB- EGF 抑制剂）组、A2780/Taxol 组和A2780/Taxol+CRM197组，采用双重免疫荧光染色法检测4组卵巢癌细胞中HB-EGF和表皮生长因子受体（EGFR）蛋白的表达，蛋白印迹法（western blot法）检测4组卵巢癌细胞中NF-κB的表达，免疫组化SP法检测4组裸鼠移植瘤组织中NF-κB蛋白的表达。
（2）NF-κB功能的检测：将A2780/Taxol细胞分4组，即空载体组、NF-κB小分子干扰RNA（siRNA）组、空载体+CRM197组、NF-κB siRNA+CRM197组，四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法检测4组A2780/Taxol细胞对紫杉醇的耐药性［以50%抑制浓度（IC50）表示］，western blot法检测4组A2780/Taxol细胞中P-糖蛋白（P-gp）的表达，流式细胞仪检测4组A2780/Taxol细胞中P-gp的功能［以细胞内累积的若丹明（Rh123）的荧光强度表示］。
（1）NF-κB表达的检测：A2780组、A2780+CRM197组、A2780/Taxol组和A2780/Taxol+CRM197组细胞中HB-EGF蛋白的表达水平分别为（5.6±1.3）、（2.1±1.2）、（11.7±3.5）、（6.2±1.4）分，EGFR蛋白的表达水平分别为（5.1±1.6）、（2.8±0.6）、（10.4±3.1）、（5.6±1.9）分，NF-κB蛋白的表达水平分别为1.89±0.23、0.74±0.12、3.45±0.16、1.31±0.08；4组裸鼠移植瘤组织中NF-κB蛋白的表达水平分别为（3.3±1.1）、（1.4±0.4）、（8.7±2.3）、（3.6±1.2）分。其中，A2780组和A2780/Taxol组细胞中HB-EGF、EGFR、NF-κB蛋白的表达水平及裸鼠移植瘤组织中NF-κB蛋白的表达水平分别高于A2780+CRM197组和A2780/Taxol+CRM197组，而A2780组细胞中HB-EGF、EGFR、NF-κB蛋白的表达水平及裸鼠移植瘤组织中NF-κB蛋白的表达水平低于A2780/Taxol组，分别比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。
（2）NF-κB功能的检测：空载体组、NF-κB siRNA组、空载体+CRM197 组、NF-κB siRNA+CRM197 组A2780/Taxol 细胞对紫杉醇的IC50 分别为（39.4±0.8）、（7.6±0.6）、（6.7±0.5）、（4.2±0.4）μmol/L，4A2780/Taxol细胞中P-gp蛋白的表达水平分别为3.11±0.23、1.45±0.16、1.73±0.21、0.68±0.14，4组A2780/Taxol细胞内的Rh123荧光强度分别为110±15、246±19、231±22、296±24。其中，NF-κB siRNA 组、空载体+CRM197 组、NF-κB siRNA+CRM197 组A2780/Taxol细胞对紫杉醇的IC50及细胞中P-gp蛋白的表达水平均明显低于空载体组（P＜0.01），而细胞内Rh123荧光强度明显高于空载体组（P＜0.01）；NF-κB siRNA组、空载+CRM197组A2780/Taxol细胞对紫杉醇的IC50及细胞中P-gp蛋白的表达水平均明显高于NF-κB siRNA+CRM197组（P＜0.01），而细胞内Rh123荧光强度明显低于NF-κB siRNA+CRM197组（P＜0.01）。
NF-κB的表达与卵巢癌紫杉醇耐药相关，HB-EGF可能通过调控EGFR/NF-κB/P-gp信号通路诱导卵巢癌对紫杉醇产生耐药。
一、NF⁃κB与HB⁃EGF调控的卵巢癌紫杉醇耐药的相关性
EGFR是由ErbB⁃1/HER1基因编码的酪氨酸激酶型受体，与肿瘤细胞的增殖、血管生成、肿瘤侵袭及转移的关系密切。HB⁃EGF作为EGFR的7种配体之一，可通过激活EGFR启动细胞间信号传导通路，从而参与调控囊胚着床、骨骼肌发育等多种生理与病理过程［8］。近年来的研究发现，HB⁃EGF与卵巢癌的关系密切，并有望成为卵巢癌治疗研究中的新靶点［5，8］。本课题组的前期研究发现，HB⁃EGF可能通过与EGFR结合将信号传导至细胞内，从而调控卵巢癌紫杉醇耐药［6］。为进一步验证HB⁃EGF通过EGFR向细胞内传导信号诱导耐药的作用，本研究通过共聚焦显微镜更为直观地观察双重免疫荧光染色法检测的A2780、A2780/Taxol 细胞中HB⁃EGF和EGFR的表达及两者的结合情况，结果与前期研究的结论一致，HB⁃EGF通过与EGFR结合从而在细胞内发挥诱导紫杉醇耐药的作用。
NF⁃κB是由Rel家族构成的二聚体蛋白，可诱导多种基因的表达，参与调节机体免疫、炎症反应以及肿瘤的生长、浸润、转移等多种病理过程［9］。NF⁃κB 已被证实与多种肿瘤的化疗耐药相关［10］。本研究发现，NF⁃κB在A2780/Taxol细胞中的表达水平显著高于A2780细胞，提示，NF⁃κB与卵巢癌紫杉醇耐药相关。Sun等［10］的研究发现，NF⁃κB与卵巢癌对顺铂等化疗药物的耐药相关，并在耐药卵巢癌细胞中高表达，与本研究结果类似。本研究还发现，通过CRM197抑制HB⁃EGF的表达则可有效抑制NF⁃κB的表达，提示，NF⁃κB参与了HB⁃EGF调控的卵巢癌紫杉醇耐药。目前，关于HB⁃EGF与卵巢癌紫杉醇耐药的研究十分有限，因此，HB⁃EGF诱导卵巢癌紫杉醇耐药的机制需要进一步的研究。
二、NF⁃κB参与HB⁃EGF调控的卵巢癌紫杉醇耐药的可能机制
P⁃gp是1种具有药物泵活性的膜蛋白，可将癌细胞内的化疗药物转运至细胞外从而导致化疗耐药，是紫杉醇耐药的经典机制之一［11⁃12］。本课题组的前期研究发现，HB⁃EGF可能通过调控P⁃gp蛋白的活性诱导卵巢癌对紫杉醇产生耐药［6］。另有研究显示，在NF⁃κB高表达的肿瘤（如肝癌等）细胞中，NF⁃κB 可通过肿瘤坏死因子等多种机制调节P⁃gp蛋白泵的活性从而诱导肿瘤对化疗药物的耐药［13⁃14］。为明确NF⁃κB是否参与HB⁃EGF调控P⁃gp诱导卵巢癌紫杉醇耐药，本研究通过RNA干扰技术抑制NF⁃κB mRNA的表达，并检测卵巢癌细胞对紫杉醇的IC50以及P⁃gp蛋白的表达及功能，探讨抑制NF⁃κB 基因的表达是否可干扰HB⁃EGF 调控P⁃gp 蛋白活性，即HB⁃EGF 是否通过NF⁃κB 调节P⁃gp诱导的卵巢癌紫杉醇耐药，结果显示，NF⁃κB基因沉默和HB⁃EGF抑制剂均可抑制A2780/Taxol细胞中P⁃gp蛋白的表达，抑制P⁃gp蛋白泵的活性并促进细胞内Rh123蓄积，从而降低A2780/Taxol细胞对紫杉醇的IC50；联合基因沉默抑制NF⁃κB的表达和HB⁃EGF抑制剂，与两者单独干预相比，则对P⁃gp蛋白的表达与活性的抑制效果更明显，细胞对紫杉醇的IC50浓度也更低。提示，HB⁃EGF可通过调控NF⁃κB和P⁃gp的表达促进细胞内紫杉醇浓度的降低，从而诱导卵巢癌细胞对紫杉醇的耐药；同时，本研究也进一步验证了HB⁃EGF诱导卵巢癌紫杉醇耐药与P⁃gp蛋白泵的相关性。
综上所述，本研究证实了NF⁃κB与卵巢癌紫杉醇耐药的相关性，并明确HB⁃EGF 可能通过调节EGFR/NF⁃κB/P⁃gp信号通路诱导卵巢癌紫杉醇耐药。本研究从HB⁃EGF这个新靶点的视角明确卵巢癌紫杉醇耐药的可能分子机制，并为卵巢癌耐药患者的临床治疗提供新的思路。
参考文献：略
本文编辑：姚红萍
