假性肥大型肌营养不良症的遗传学分析及产前诊断

     DMD 基因为人类最大的基因之一，人类孟德 尔遗传在线数据库(OMIM)中编号为 300377，其位 于Xp21.1~p21.2(31119218~33339608)，全长2 220 391 bp，含 79 个外显子和 7 个启动子。DMD基因的结构复杂，突变频率高且类型多样，最常见 的突变类型为外显子缺失突变(占 55%~65%)，其 次为外显子重复突变(占 5~10%)，其他微小突变 占 25%~30%[4]。

     本研究中，采用MLPA技术检测到DMD基因 外显子缺失患者占 59.6%(56/94)，外显子重复患者 占 10.6%(10/94)，与之前文献的报道[5⁃6]一致;其中 缺失集中于外显子 45~54，该热点区域与之前多 篇文献的报道[6⁃7]一致。本研究所发现的缺失分布 于整个 DMD 基因，包括启动子区，也有保守的 3 ′ 末 端。在基因缺失的热点区域外显子 45~54 之间， 占全部缺失的 44.6%，提示 DMD 基因突变主要以小 片段缺失为主。缺失热点区域的存在可能是由DMD 基因内含子的结构决定的，内含子中的许多 重复序列决定了其存在多个断裂位点。本研究检 出 DMD 外显子重复突变者 10 例，主要分布于外显 子 2~30 区域，不同于文献报道的重复突变热点区 域在外显子 3~11 和 21~37 区域[8]，可能与本研究 的样本量较少有关。外显子 2~7 为最常见的重复 片段，与内含子 2 存在 2 个断裂热点有关。DMD 基因 外显子重复突变的发生，可能通过姊妹染色体的非 等位同源重组(non⁃allelic homologous recombination ，NAHR)机制所致[9]，这还需要进一步研究。

     根据 Monaco 等[10]提出的“开放阅读框规则”，DMD 基因突变若导致其 mRNA 编码阅读框中断， 进而使抗肌萎缩蛋白的结构域遭到严重破坏，产生截短且无功能的抗肌萎缩蛋白，患者多表现为症状 较重的杜兴型肌营养不良症;若突变的发生不影响mRNA 编码阅读框，则抗肌萎缩蛋白仍有部分表达 或仍保存部分功能，则导致临床表型较轻的贝克型 肌营养不良症。临床表型的严重程度并不取决于 突变片段的大小，在已收录的 DMD 基因突变数据 库中，约 91% 的 DMD 基因突变与表型之间的关系 符合这一规则[11]。本研究中，62 例(93.9%)假性肥 大型肌营养不良症患者的表型与该规则相符，余 4 例DMD 患者不符。对于不符合该规则的患者，可能 是由于 DMD 基因突变位于抗肌萎缩蛋白结构域中 的重要区域(如半胱氨酸富集区)，也有可能是影响 到剪切位点，造成 RNA 水平的“框外突变”，已有相 关实验证实了此类现象的发生[12]。对于不符合开 放阅读框规则者，有待在 RNA 及蛋白质水平上进 一步研究。

    假性肥大型肌营养不良症先证者的女性家系 成员是否为致病基因携带者，对疾病在家族中的再 发风险有重大影响，因此，对女性携带者的诊断是 临床遗传咨询中的重点。本研究采集假性肥大型 肌营养不良症先证者的母亲的血样同时进行检测， 除4例先证者的母亲拒绝检测外，余62例先证者的 母亲中，有相应外显子拷贝数变异者为 40 例，携带 率为 64.5%;而另外 35.5% 先证者的母亲并不是突 变携带者，这些先证者的 DMD 基因突变可能为新 生突变。由于 DMD 基因巨大，拥有外显子的数量 较多，存在高度重复结构，在卵母细胞有丝分裂和 减数分裂过程均容易发生错误，因此 DMD 基因具 有较高的新生突变率。据报道，大约有 2/3 的假性 肥大型肌营养不良症先证者的母亲为携带者，约1/3 为新生突变，表现为散发病例[13]，与本研究的结 果相似。

     另有报道认为，生殖腺嵌合也是导致 DMD 新 生突变的原因之一[14]。生殖腺嵌合是指女性生殖 细胞在有丝分裂的过程中发生突变，只有部分卵母 细胞中携带突变的 X 染色体，再次妊娠生育患病男 性子代的概率取决于突变细胞的比例。有研究应用荧光原位杂交技术及测序技术都诊断出了 DMD基因缺失的体细胞嵌合体[15⁃16]。因此，对新发突变 的家系进行遗传咨询时，须考虑生殖腺嵌合的可 能，对有假性肥大型肌营养不良症先证者的家系均 应视为高风险家系，无论孕妇是否为携带者或存在 携带突变基因的嵌合体，均建议进行产前诊断。本研究中，有 5 例非携带者孕妇行产前诊断，胎儿均未检出 DMD 基因致病突变，但也不能完全排除生殖 腺嵌合的存在。

     目前，国内常用的检测 DMD 基因突变的技术 有:多重 PCR 技术，MLPA 技术及高通量测序(即新 一 代 测 序 ;next -generation sequencing，NGS)技 术 等。多重 PCR 技术是过去近 20 年公认的 DMD 基 因检测方法，能够检测到覆盖 DMD 基因 18 个突变 热点外显子的缺失突变，但无法检测全部 79 个外 显子，也不能检测重复突变及杂合状态。MLPA 技 术是荷兰学者Schouten等[17]于2002年建立的1种 在单一反应管内可同时检测多达 40 个不同核苷酸 序列拷贝数变化(检测 DMD 基因的 MLPA 试剂盒P034和P035各有49个和48个探针，除检测79个 外显子外还有在 X 染色体的内参照探针)的检测方 法，操作简单，检测所需的核酸量少。其原理是，依 据目的基因的保守序列设计 1 对探针，只有这对探 针与待检测 DNA 互补并连接后，才能进行 PCR 扩 增并收集相应探针的扩增信号峰，如果靶序列缺 失、点突变、拷贝数改变，则相应探针的扩增信号峰 就会缺失、降低或增加，根据峰值与正常对照的比 值，可判断靶序列是否存在相应基因片段的缺失或 拷贝数的改变。MLPA 技术不仅能够检测 1~79 外 显子的缺失和(或)重复，且可检测杂合状态，能够 诊断携带者。DMD 基因突变以外显子缺失和(或) 重复多见，本研究中 70.2% 的假性肥大型肌营养不 良症先证者存在外显子的缺失或重复，使用 MLPA技术经济有效。此外，对于先证者已经去世，无法 进行明确的基因诊断，而其女性家系成员有生育意 愿，本研究应用 MLPA 技术确诊了 5 例女性致病突 变携带者，为其以后再次妊娠时行产前诊断提供了 依据。

      MLPA 技术也存在其局限性，DMD 基因的微小 突变占 25%~30%，包括点突变，微小缺失或插入 突变，MLPA 技术对微小突变的检测效率较低。2011年，Lim等[18]建立NGS平台并应用于假性肥 大 型肌营养不良症患者的基因测序，证实了其的可 行性。目前，国内实验室对于微小突变的检测多用NGS[19]，原理为先用靶向富集技术捕获基因组的外 显子区域，再通过 NGS 测序获得编码区序列，进而 发现基因的变异，该方法的成本较一代测序低。本 研究中，MLPA 技术未检测出突变的 28 例假性肥大型肌营养不良症先证者中，有 2 例在外院行 NGS 测 序，检出致病性突变。应用 NGS 技术检测 DMD 基 因的微小突变，可提高 DMD 基因突变的检出率。 因此，MLPA 技术作为 1 种高通量的检测技术，可作 为假性肥大型肌营养不良症患者初步筛查外显子 缺失和(或)重复的 1 种方法[20]，对于 MLPA 检测阴 性者，需进一步行 DMD 基因的测序以提高检出率。