子宫颈癌HPV疫苗的研究现状
选自：中华妇产科杂志2019 年4月第54 卷第4期
作者：王仁杰 李悦含 耿玉笛 高纯 陈刚 汪辉 靳镭 马丁 廖书杰
华中科技大学同济医学院附属同济医院妇产科，武汉430030
通信作者：廖书杰，Email：sjliao@tjh.tjmu.edu.cn
子宫颈癌是威胁女性健康的常见妇科恶性肿瘤之一，持续性高危型HPV感染与子宫颈癌的发生、发展密切相关，通过免疫治疗途径相继出现了预防性和治疗性HPV疫苗。迄今，已有3种预防性HPV疫苗得到批准并广泛使用，均显示出高效性和安全性，但无法消除已经存在的HPV感染；治疗性HPV疫苗的研发也已取得了新的进展，包括活载体疫苗、多肽和蛋白质疫苗、核酸疫苗以及细胞疫苗等。这些疫苗具有巨大的治疗潜力，但仍处于基础研究和临床试验阶段，实际应用有限。本文回顾了子宫颈癌HPV疫苗的研究进展和应用情况，总结各种疫苗的优点和不足之处，分析疫苗的应用前景，旨在为中国人研发原创型子宫颈癌HPV疫苗奠定基础。
子宫颈癌是全球范围内居第4 位的妇科恶性肿瘤，2015年我国约有10万例女性患病，约3万例患者死亡，而且子宫颈癌的发病率呈快速上升趋势，对女性的身体健康造成巨大的威胁［1］。目前的研究已明确，子宫颈癌的发生与HPV感染密切相关。流行病学研究也显示，约99.7%的子宫颈癌患者合并有HPV感染［2］，持续性高危型HPV感染是子宫颈癌发病的最主要原因，HPV16和18型是两种最常见的高危型HPV，分别占62.6%和15.7%［3］。
HPV是子宫颈癌发生、发展的主要原因，主要通过性接触传播。据估计，大多数性活跃的女性一生中至少会感染1种HPV型别，大多数子宫颈HPV感染在1年或2年内自行消退；但在某些个体中，持续性感染可能导致尖锐湿疣、子宫颈癌前病变甚至是癌变［4］。HPV的基因组编码6种早期调节蛋白（即E1、E2、E4、E5、E6 和E7）和2 种晚期结构蛋白（即L1和L2）。早期调节蛋白调控HPV DNA的复制、转录以及恶性转化，而晚期结构蛋白编码HPV衣壳蛋白。
目前，HPV感染相关的子宫颈癌及其他疾病的免疫治疗成为研究热点，预防性和治疗性HPV疫苗的研发已经取得了一定的成果，但预防性疫苗仍存在缺陷，治疗性疫苗尚处于临床试验阶段。本文旨在对子宫颈癌HPV疫苗的研究进展及应用情况进行综述，为疫苗的进一步研究、欠发达国家和地区的推广以及研发中国人原创型子宫颈癌HPV疫苗奠定基础。
预防性HPV疫苗由重组HPV衣壳蛋白L1组装的病毒样颗粒（virus⁃like particles，VLP）构成，针对特定的致癌HPV型别产生中和抗体，预防初治个体的HPV感染。VLP不含遗传物质，因此，无HPV感染或致癌的风险。而且与天然的衣壳蛋白相比，预防性HPV疫苗显示出更强的免疫原性，能够产生显著高于天然HPV的病毒抗体滴度，诱导强烈的保护性免疫应答。
目前，美国食品药品管理局（FDA）批准上市的HPV疫苗有3种，包括四价HPV疫苗（即Gardasil，覆盖HPV 6、11、16、18型）、二价HPV疫苗（即Cervarix，覆盖HPV 16、18型）以及九价HPV疫苗（即Gardasil 9，覆盖HPV 6、11、16、18、31、33、45、52、58型）。见表1。
1. 预防性HPV疫苗的效果：预防性HPV疫苗的使用已有10年，高接种率国家的HPV16、18型感染已减少，HPV相关疾病也大大减少，如尖锐湿疣、子宫颈细胞的异型增生和子宫颈癌［5］。据报道，9～15岁的女性接种3剂量的HPV疫苗后，发现四价、二价、九价HPV疫苗的抗体滴度分别能够至少持续9.9、10.0、5.0年［6］。
最近1项针对四价HPV疫苗的荟萃分析显示，与未接种疫苗的人群相比，接触HPV前接种四价HPV疫苗的人群其HPV 6、11、16、18型的感染率最高可下降约90%，尖锐湿疣、子宫颈细胞的异型增生和子宫颈癌的发生率也在持续下降［7］。1项二价HPV疫苗的随机对照试验结果显示，疫苗能够保护接种者免受HPV 16、18型感染，且子宫颈上皮内瘤变（CIN）的发生率下降［8］。另外1项针对16～26岁年轻女性的随机双盲试验中，与接种四价HPV疫苗组相比，接种九价HPV疫苗组与HPV 31、33、45、52、58型感染相关的高级别子宫颈、外阴及阴道病变的发生率显著降低，疫苗的疗效持续6年之久，而且能够预防90%的子宫颈癌的发生［9］。
2. 预防性HPV疫苗的安全性和局限性：迄今为止，全球已经接种超过2亿剂HPV疫苗［7］，越来越多的证据证实了疫苗的安全性［10］，但随之也出现了一系列的安全问题［11］，如局部疼痛、肿胀和红斑以及发热、头痛、恶心、肌肉关节痛等。临床试验发现，与接种四价HPV疫苗相比，九价HPV疫苗的局部副反应更常见［9］。有研究显示，疫苗组（接种四价HPV 疫苗）和安慰剂组分别仅有21 例（0.1%）和19 例（0.1%）死亡，并且均未发生疫苗相关的死亡案例，而且超过90%的不良事件被归为非严重事件［11］。接种HPV疫苗后严重不良事件非常罕见，原因尚不清楚。但严重不良事件可能导致参与接种疫苗的人数减少，因此，仍需要进行长期的调查和研究，确定接种疫苗的高风险人群。
目前，已上市的3种HPV疫苗均用于预防HPV感染，而对已经存在的HPV感染的作用较小。原因在于早期病变时循环系统和淋巴系统中不存在HPV抗原，难以产生强大的体液免疫；此外病毒蛋白不能在细胞表面明显暴露，免疫球蛋白难以有效根除已有的HPV 感染［12］。几项对已感染HPV 的女性使用HPV 疫苗的研究得出了矛盾的结果，Hildesheim等［13］发现，二价HPV疫苗的接种对HPV感染后的女性没有治疗作用；而Kang等［14］发现，接种四价HPV疫苗后可以阻止CINⅡ～Ⅲ的复发。此外，HPV疫苗使用的体外基因表达载体，制造过程复杂，价格相对较高，使疫苗难以在低收入人群中普及。因此，需进一步研究研发价廉且广泛靶向的HPV疫苗，并降低HPV相关疾病的发生、发展。
3. 预防性HPV疫苗的发展前景：目前，有实验室研究了基于L2蛋白的HPV L2疫苗，该疫苗具有很大的潜力，能够提供较低的接种价格并且广谱预防HPV的感染［15］。但与基于其他表达系统的HPV L1 VLP疫苗相比，HPV L2疫苗的免疫原性较差，产生的抗体滴度较低。目前，采用了多种策略促进HPV L2疫苗的免疫应答，包括优化L2抗原表位、与融合配偶体结合的方法等［16⁃17］。此外，HPV L1 VLP疫苗正在研究中，取得了一定的成功，该疫苗可以通过大肠埃希菌等进行生产，目前正处于临床前或临床试验的阶段（临床试验注册号：NCT03813940、NCT02740777等，http：//adisinsight. springer.com/），预计不久的将来能够实现商业化。
与预防性HPV疫苗相比，治疗性HPV疫苗能够诱导产生针对肿瘤抗原的细胞毒性T 淋巴细胞（cytotoxic Tlymphocyte，CTL），治疗已经发生HPV感染的患者。目前，有多种疫苗处于研发之中，包括活载体疫苗、多肽和蛋白质疫苗、核酸疫苗以及细胞疫苗等。
活载体疫苗包括细菌或病毒载体的疫苗，这些重组载体可以在宿主体内复制表达，将HPV E6和E7抗原呈递给抗原呈递细胞，诱导CD8+ CTL和CD4+T辅助细胞的产生，提供高水平的免疫原性。然而，由于接种活载体疫苗能够产生载体的中和抗体，导致反复接种活载体疫苗产生的免疫效应有限［18］，而且活载体疫苗对于免疫力低下的人群存在潜在的安全风险［12］。
1. 细菌载体疫苗：减毒活细菌载体能够诱导黏膜免疫、体液免疫和细胞免疫。通过删除毒性调节系统或芳香氨基酸生物合成途径所涉及的必要基因，细菌的毒性得以衰减，无法在宿主体内繁殖，同时也保留了合成编码抗原的能力。细菌载体包括单核细胞增多性李斯特菌（listeria monocytogenes，Lm）、干酪乳杆菌、乳酸乳杆菌和沙门菌。
目前，最常用的细菌载体是Lm，Lm属革兰阳性胞内兼性厌氧菌，能够进入吞噬体，分泌膜活性毒性因子李斯特菌溶胞素O（listeriolysin O，LLO）和磷脂酶C，降解吞噬溶酶体膜，进入细胞质表达蛋白质后，激活内源性抗原处理途径［19］。1项Ⅰ期临床试验中，研究者纳入15例晚期子宫颈癌患者，使用基于E7蛋白的减毒活细菌疫苗Lm⁃LLO⁃E7，结果发现，3例患者出现E7蛋白特异性的γ干扰素（IFN⁃γ）+T淋巴细胞的增多，4例患者肿瘤体积缩小［20］。最近的1项临床试验中，17例HPV 16型阳性的CIN Ⅲ患者测试了基于E7蛋白的减毒干酪乳杆菌疫苗——GLBL101c的安全性和临床疗效，结果显示，10例患者出现E7特异性黏膜免疫，9例患者病变降至CIN Ⅱ，无一例发生不良事件［21］。
细菌载体的优点在于制作工艺相对简单，生产成本低廉，适合大规模生产，同时该载体有着较大的外源性DNA的插入容量，当出现不良反应时，可口服抗生素根除［19］。但是细菌载体存在安全隐患和反复接种的缺陷，未来需进一步研究克服这些不足。
2. 病毒载体疫苗：病毒载体疫苗通过将目的基因重组到病毒基因组中制成重组病毒载体，感染宿主细胞后大量表达目的基因产生保护性抗原，刺激机体产生特异性免疫反应，同时重组病毒载体本身也可发挥佐剂效应增强免疫反应。病毒载体包括腺病毒、腺相关病毒、甲病毒、痘苗病毒等。
腺病毒是1种线性无包膜的双链DNA病毒，对细胞表现出广泛的趋向性而用于基因治疗以及载体疫苗的研发。删除腺病毒中调控基因表达的早期转录基因E1A区后插入靶基因，能够制成复制缺陷型腺病毒载体。腺病毒的早期转录基因E3序列可以作为额外的外源基因插入区，E1/E3缺失载体可以容纳大约6.5 kb的外源基因［19］。Khan等［22］的研究中，使用血清型为Ad26和Ad35的罕见人类腺病毒作为载体，编码E2、E6、E7融合蛋白治疗HPV16、18型相关性疾病，小鼠的免疫反应出现了强大的T淋巴细胞免疫和抗肿瘤保护。腺病毒作为载体有着诸多优点，如宿主细胞范围广、诱导机体产生的免疫反应较强等；但是病毒载体进入宿主细胞后，易随细胞分裂或死亡而消失，表达的持续时间缩短，不利于产生持久的免疫反应，限制了疫苗的使用。
痘苗病毒载体在抗原特异性免疫治疗中拥有良好的发展前景，临床试验中能有效促进病变的消退［23］。E2能够抑制E6和E7的表达和癌细胞生长，诱导癌细胞的凋亡，基于E2的痘苗病毒载体疫苗可抑制已感染宿主细胞中的E6和E7 活性，减少HPV 感染细胞的转化以及肿瘤细胞的存活［24］。最近的1项纳入了1 356例HPV感染相关的上皮内病变患者的Ⅲ期临床试验中，基于HPV16 E2的重组修饰痘苗病毒Ankara（MVA⁃E2）在治疗HPV感染引起的肛门与生殖器上皮病变中，1 051例（89.0%）女性患者以及全部男性患者的病变消除，28例（2.4%）女性患者的病变降至CIN Ⅰ［25］。痘苗病毒的优点在于其庞大而稳定的基因组能够支持大量基因的插入和稳定表达，在感染细胞被机体清除之前能够表达1周时间，而且基因的表达发生在人类体细胞的细胞质中，插入突变的风险也相对较低［19］。
与活载体疫苗相比，多肽和蛋白质疫苗更加安全、稳定和易于生产，但是疫苗的低免疫原性限制了其对恶性肿瘤的治疗效果，因此，需要使用佐剂或免疫刺激分子增强其免疫效应［26］。
1. 多肽疫苗：多肽疫苗的缺陷在于较差的免疫原性和主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）限制性［24］。MHC限制性要求为个体确定特定HPV抗原的免疫抗原表位，限制了多肽疫苗的大规模生产及应用。较差的免疫原性可以通过使用佐剂如趋化因子、细胞因子、Toll样受体（TLR）配体等来提升多肽疫苗的效价强度，增强CD8+ T淋巴细胞应答；而为了克服MHC限制性，使用含有E6、E7的重叠合成长多肽（synthetic long peptides，SLP），能够改善T淋巴细胞的应答。最近的1项Ⅰ期临床试验中，研究者使用4种HPV 16型E6合成肽和新型佐剂白假丝酵母菌皮试抗原（Candin）构成的多肽疫苗PepCan，结果显示，45%的患者出现了病变的消退以及病毒载量的降低［27］。目前，评估多肽疫苗PepCan疗效和安全性的Ⅱ期随机、双盲临床试验正在进行（临床试验注册号：NCT02481414）。
2. 蛋白质疫苗：相比多肽疫苗，蛋白质疫苗有大量CD4+和CD8+ T淋巴细胞抗原表位，因此无MHC限制性，适用范围更广。但蛋白质疫苗主要通过MHCⅡ类分子呈递抗原，只能激活抗体应答而无法产生CTL免疫应答。为了增强免疫原性和激活CTL免疫应答，需要添加佐剂和免疫刺激分子，增强内源性处理以及将抗原靶向树突状细胞（dendritic cells，DC）［19，24］。组织抗原（TA）⁃CIN 是1 种由HPV 16 L2、E6和E7融合蛋白构成的蛋白质疫苗，1项治疗外阴上皮内瘤变Ⅱ～Ⅲ级患者的Ⅱ期临床试验中，接种该疫苗1年内，63%的患者出现了病变的消退［28］。目前的1项Ⅰ期临床试验旨在评估TA⁃CIN在HPV16型相关子宫颈癌患者的辅助治疗中的安全性和可行性，该试验于2018年10月开始研究（临床试验注册号：NCT02405221）。在HPV致癌的过程中，对子宫颈癌发生的不同阶段发挥作用的蛋白质进行深入的研究，制备适用于不同时期患者的蛋白质疫苗，能更加有效地发挥疫苗的免疫疗效。
1. DNA疫苗：DNA疫苗通过将编码特定病毒抗原的质粒DNA转移到宿主组织中，转染细胞并表达蛋白质。DNA疫苗安全稳定，易于生产，与RNA疫苗或蛋白质疫苗相比，DNA疫苗的抗原在细胞内可持续表达更长的时间。此外，与活载体疫苗和蛋白质疫苗不同，DNA疫苗接种后机体不会产生对载体的抗体，因此适合反复接种［29］。使用经过修饰的E6和E7基因，不会编码致癌性的蛋白质，从而避免质粒DNA 整合进入宿主基因组后的潜在安全风险。但是，DNA疫苗的免疫原性较低，因此，目前的研究主要为增加抗原表达和DC的数量、改善抗原处理和递呈的能力、增强DC与T淋巴细胞相互作用的方法等［24］。
为了增强DC抗原处理和递呈的能力，Kim等［30］研发了1种共同表达HPV 16、18型E6和E7以及Fms样酪氨酸激酶3配体（Flt3L）的DNA疫苗GX⁃188E，Flt3L是1种DC激活剂，能够增强DC的功能，该研究发现，在9例HPV 16、18型阳性的CIN Ⅲ患者中，8例出现了增强的HPV特异性CD8+T淋巴细胞反应，7例患者出现了病毒的清除和病变的完全消退。目前，关于DNA疫苗GX⁃188E的几项临床试验正在进行中，如DNA疫苗GX⁃188E用于HPV16、18型CINⅡ、CINⅡ～Ⅲ和CINⅢ患者的Ⅱ期临床试验（临床试验注册号：NCT02596243），以及用于评估DNA 疫苗GX⁃188E 在HPV16、18型CIN Ⅲ患者安全性和有效性的临床试验（临床试验注册号：NCT03206138）。
通过电穿孔、封装、基因枪或激光治疗进行疫苗转移也可以有效增强DNA疫苗的免疫原性［26］。Kim等［30］通过电穿孔增强DNA疫苗GX⁃188E的免疫原性，优先将HPV抗原靶向DC。另1项随机、双盲和使用安慰剂对照的临床试验中，对CINⅡ～Ⅲ患者使用基于HPV 16、18型E6和E7的DNA疫苗VGX⁃3100，肌内注射后采用电穿孔进行疫苗转移，结果显示，49.5%的患者出现了病变的消退［31］。目前，DNA疫苗VGX⁃3100在多项临床试验（临床试验注册号：NCT02163057，NCT03185013）中进行测试，有着良好的应用前景。
最近，基因组编辑工具［24］如锌指核酸酶（zinc finger nucleases，ZFN）、转录激活因子样效应核酸酶（transcription activator⁃like effector nucleases）和基因编辑技术CRISPR/Cas9在治疗HPV导致的恶性肿瘤时，在HPV阳性细胞系中能够诱导HPV阳性细胞的凋亡、抑制细胞的生长并且降低细胞的致瘤性。最近1项治疗HPV相关恶性肿瘤的Ⅰ期临床试验（临床试验注册号：NCT02800369）中，使用ZFN⁃603和ZFN⁃758特异性切割HPV 16、18型E7致癌基因，降低E7的表达，特异性诱导HPV16、18型阳性细胞的凋亡和生长抑制。这些新兴的方法可能成为子宫颈癌治疗的突破点，阻止CIN的恶性进展并降低子宫颈癌的发病率。
2. RNA疫苗：RNA疫苗与DNA疫苗类似，接种后机体不产生针对载体的中和抗体，因此可以反复接种。但与DNA疫苗不同的是，RNA疫苗不会出现染色体融合和细胞转化，因此更加有效和安全［24］。此外，RNA疫苗在细胞质中直接表达，仅需穿过细胞膜，因此提高了转染成功的可能性［19］。RNA疫苗的缺陷在于稳定性差、制造困难而且无法在细胞间转移，因此，目前缺乏HPV相关疾病的研究。已有研究使用纳米颗粒封装mRNA，避免mRNA的降解并提高了转染的效率［32］。mRNA分子以及纳米颗粒封装的技术作为基因治疗工具展现了巨大的潜力，为子宫颈癌的治疗提供了新的思路。
细胞疫苗，使用的是来自患者的经过修饰和调整的免疫细胞，有强烈的抗癌细胞效应。
1. DC疫苗：DC是体内免疫系统的重要组成部分，是激活CD8+和CD4+ T淋巴细胞的最主要而且效率最高的抗原呈递细胞。在体外，DC在装载HPV特异性多肽和蛋白质抗原后或在转导后表达抗原，可以诱导机体产生对病毒抗原的特异性免疫反应。此外，DC可以作为自然佐剂提升特异性抗原的效能，产生更强的抗肿瘤免疫效应。有研究证明，免疫前DC（PIDC）可以治疗晚期子宫颈癌患者，Rahma等［33］使用HPV 16型E6或E7处理过的PIDC治疗晚期子宫颈癌患者，结果显示，63%（E6）和58%（E7）的患者出现了对病毒的特异性免疫应答。但DC疫苗存在着局限性，例如难以从患者获得大量的DC，而且需要体外处理细胞，操作制备过程复杂，难以实现大规模生产。此外，细胞培养技术的不同会导致DC疫苗的质量不一致，DC的转导效率相对较低，终末分化的DC不能在体外扩增而且自体DC寿命较短［34］。因此，一些研究尝试着改善这些缺陷，例如使用小分子干扰RNA靶向沉默凋亡分子或免疫抑制因子的表达，改善DC疫苗的效应［35］。
2. 过继细胞转移：过继细胞转移（adoptive cell transfer，ACT）是通过体外诱导恶性肿瘤抗原特异性的CTL，转移到体内增强抗肿瘤免疫。ACT的优点在于可以在体外大量生产，并且允许在转移前进行处理，例如去除免疫抑制细胞如调节性T淋巴细胞［34］。与转移到体内后再激活CTL的DC疫苗不同，ACT能够直接作用于靶细胞，提供肿瘤细胞的杀伤作用。1项针对HPV相关恶性肿瘤的临床试验中（临床试验注册号：NCT02280811），纳入12例HPV16型阳性的恶性肿瘤患者，使用E6特异性T淋巴细胞受体改造的T淋巴细胞治疗后，2例患者的肿瘤出现消退。单独使用CTL可能不足以消除晚期患者的癌细胞，实体瘤的治疗仍然是个挑战。有效的T淋巴细胞治疗需要改善和解决肿瘤异质性、抗原逃逸和免疫抑制微环境等问题［24］，这些尚需进一步的研究。
子宫颈癌的预防性HPV疫苗已经取得令人瞩目的成果，过去10年的研究数据表明，3种预防性HPV疫苗非常有效、可靠和安全，这在人类恶性肿瘤治疗史中有着里程碑式的意义，但仍存在诸多问题，如不良事件的出现等。理想的预防性HPV疫苗要有更高的效果、安全性和持续时间，更低的生产成本和价格，更大的覆盖范围，使更广泛的人群受益。目前，治疗性HPV疫苗在临床试验中已取得进展，为治愈子宫颈癌提供了可能性。新型子宫颈癌HPV疫苗要能够改善目前已有疫苗的缺陷，兼顾预防与治疗，同时保持低价、安全、高效。虽然目前仍面临着诸多挑战，但随着对HPV和子宫颈癌发病机制研究的深入，人类将有希望实现对子宫颈癌的彻底防治。
参考文献：略
本文编辑：姚红萍
文章很好，我喜欢。